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    分子診斷平臺大盤(pán)點(diǎn)

    隨著(zhù)技術(shù)的進(jìn)步,分子診斷產(chǎn)品發(fā)展的越發(fā)成熟,按照技術(shù)原理,可以將上市分子診斷技術(shù)大致劃分為數字PCR技術(shù)、分子雜交、基因測序、核酸質(zhì)譜、生物芯片5大類(lèi)。未來(lái)3-5年IVD行業(yè)最具發(fā)展潛力的產(chǎn)品線(xiàn)是什么?答案無(wú)疑是分子診斷。狹義的分子診斷是基于核酸的診斷技術(shù)。

    隨著(zhù)基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)等新興學(xué)科的發(fā)展,分子診斷的內涵已經(jīng)從DNA/RNA拷貝、突變等檢測,拓展到核酸與DNA片段、蛋白與多肽、抗原與抗體、受體與配體等生物大分子的檢測。從目前市場(chǎng)分子診斷產(chǎn)品來(lái)看,基于核酸診斷技術(shù)的產(chǎn)品仍占主流位置。

    分子診斷技術(shù)體系:

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    PCR

    從各類(lèi)技術(shù)類(lèi)別來(lái)看,PCR技術(shù)由于壁壘相對較低,國產(chǎn)化程度高,國內企業(yè)布局相對較早,因此基于PCR技術(shù)的分子診斷產(chǎn)品占總產(chǎn)品量的70%以上。PCR技術(shù)是一種用于擴增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù),基本原理是在反應室中模擬細胞內的DNA復制,即人為創(chuàng )造核酸半保留復制條件,使目的DNA在細胞外完成擴增的過(guò)程。通過(guò)PCR技術(shù)進(jìn)行分子診斷的流程如下:核酸提取——核酸擴增——核酸檢測。按照靶標數量劃分,PCR技術(shù)平臺通??煞譃閝PCR和ddPCR。

    實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)

    Real-time PCR,美國PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出來(lái)的一種新的核酸定量技術(shù),該技術(shù)是在常規PCR基礎上加入熒光標記探針來(lái)實(shí)現其定量功能的,與普通PCR相比,實(shí)時(shí)定量PCR具有許多優(yōu)點(diǎn):利用熒光信號的變化實(shí)時(shí)檢測PCR擴增反應中每一個(gè)循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化,最終對起始模板的定量分析。

    ddPCR(數字PCR)

    ddPCR系統利用油包水技術(shù),在傳統的PCR擴增前將一個(gè)大的反應體系進(jìn)行微滴化處理,將此反應體系分割為成千上萬(wàn)個(gè)微滴,即成千上萬(wàn)個(gè)獨立的PCR反應體系。在此過(guò)程中,樣品被稀釋至單分子水平,并被平均分配到這幾萬(wàn)個(gè)反應體系中,每個(gè)微滴中不含或者含有至少一個(gè)待檢測的核酸靶分子,這樣也相當于變相的對靶基因進(jìn)行富集。目前,國內市場(chǎng)已現10余家數字PCR儀廠(chǎng)商,其中領(lǐng)航基因自主研發(fā)的數字PCR系統已獲NMPA認證,銳訊生物、新羿生物、STILLA、伯樂(lè )還在申報中。

    核酸測序

    經(jīng)典的Sanger測序技術(shù),被稱(chēng)作是測序屆金標準。隨著(zhù)高通量測序技術(shù)應用拓展,基因測序技術(shù)將不斷升級,也將進(jìn)一步提高占比,成為未來(lái)腫瘤檢測的主要技術(shù)。目前測序市場(chǎng)主流為NGS測序平臺。

    二代測序(NGS)在臨床領(lǐng)域的應用快速增漲,其在臨床上的應用主要包括疾病目標基因集測序(disease-targeted gene panels)、全外顯子組測序(whole exome sequencing , WES)和全基因組測序(whole genome sequencing , WGS)??傮w來(lái)說(shuō),NGS技術(shù)具有通量大、時(shí)間短、精確度高和信息量豐富等優(yōu)點(diǎn),可以在短時(shí)間內對感興趣的基因進(jìn)行精確定位。

    在二代測序領(lǐng)域,筆者知道的測序平臺就達三十多個(gè),Illumina毫無(wú)疑問(wèn)是行業(yè)巨頭,其市場(chǎng)規模甚至達到壟斷地步。目前已獲中國國家藥品監督管理局醫療器械批準的基因測序儀包括:Illumina MiSeq?Dx;華大智造BGISEQ-100、BGISEQ-1000、BGISEQ-500、BGISEQ-50、MGISEQ-2000、MGISEQ-200共6款基因測序儀。

    單細胞測序,第三代測序技術(shù)的核心理念是以單分子為目標的邊合成邊測序,單分子測序平臺給測序技術(shù)帶來(lái)新思路,部分已經(jīng)開(kāi)始商業(yè)化推廣,但尚未達到NGS的規模。相比二代測序,第三代測序技術(shù)在臨床上的應用有明顯優(yōu)勢:第三代測序技術(shù)不需要PCR擴增,可直接對單個(gè)分子進(jìn)行測序;樣品制備簡(jiǎn)單,測序成本進(jìn)一步降低;可直接讀取RNA的序列和包括甲基化在內的DNA修飾。這些優(yōu)勢可以大大改善臨床基因測序的成本、速度和質(zhì)量,但單分子測序有通量限制,所以并不適合獨立做全基因組測序,更適于針對有限的、個(gè)性化的、目標性的應用。

    幾家重要的單分子測序平臺一覽:

    Helicos BioSciences:第一臺真正的單分子測序儀

    Pacific Biosciences(PacBio):首個(gè)單分子實(shí)時(shí)測序系統

    Oxford Nanopore Technologies:納米孔測序、迷你測序儀

    分子雜交

    核酸分子雜交技術(shù)是利用DNA 變性與復性的原理,把不同的DNA 單鏈分子或者DNA 與RNA 的混合物放在同一溶液中,在某種理化因素作用下DNA 雙鏈分子解鏈變性,這樣互補序列的DNA 之間或DNA 與RNA 之間形成雜化的雙鏈。

    核酸分子雜交技術(shù)可分為Southern 雜交——DNA和DNA分子之間的雜交;Northern雜交——DNA和RNA分子之間的雜交。

    蛋白雜交,也叫Western 雜交,蛋白質(zhì)分子雜交是一種借助特異性抗體鑒定抗原的有效方法,即蛋白質(zhì)分子(抗原—抗體)之間的雜交。

    核酸質(zhì)譜

    目前核酸分析所使用的質(zhì)譜電離技術(shù)主要還是采用 ESI 和MALDI。 簡(jiǎn)單來(lái)講,兩種電離技術(shù)都是軟電離,ESI 檢測的特點(diǎn)是生物大分子帶多個(gè)電荷,質(zhì)荷比范圍基本在2000 Da 以下區間,從而能檢測幾萬(wàn)乃至更大的生物分子;而MALDI 常得到單電荷峰,與飛行時(shí)間(TOF)分析器搭配,檢測范圍可以到幾十萬(wàn)道爾頓。

    Agena MassARRAY 核酸質(zhì)譜

    質(zhì)譜技術(shù)相比于其他檢測技術(shù)具有快速、準確、靈敏度高、高通量等優(yōu)點(diǎn),近年來(lái)在核酸的高級結構鑒定、寡核苷酸與小分子的相互作用、DNA 損傷與修飾等領(lǐng)域有著(zhù)廣泛的應用。

    由于生物樣品的復雜性,質(zhì)譜技術(shù)還面臨著(zhù)一些挑戰和困難。但生物質(zhì)譜技術(shù)是科學(xué)研究的有力工具,隨著(zhù)臨床實(shí)驗室對質(zhì)譜的了解和應用不斷的加深,未來(lái)該檢測平臺或可成為規范實(shí)驗室不可或缺的標準裝備。

    生物芯片

    微陣列芯片

    也就是常說(shuō)的基因芯片,又稱(chēng)DNA微陣列(DNA micro-array)、SNP芯片,是把大量已知序列探針集成在同一個(gè)基片(如玻片、膜)上,經(jīng)過(guò)標記的若干靶核苷酸序列與芯片特定位點(diǎn)上的探針雜交,通過(guò)檢測雜交信號,對生物細胞或組織中大量的基因信息進(jìn)行分析。

    與傳統的染色體核型分析技術(shù)相比具有更高的分辨率,可識別Kb級別以上的染色體細微失衡?;蛐酒壳耙殉蔀閲鴥韧馀R床遺傳學(xué)診斷的一項常規的技術(shù),在遺傳病檢測、疾病篩查、疾病分型、病原體檢測、個(gè)性化用藥等方面均呈現出廣闊的應用前景。

    全球知名的芯片公司有 Illumina、Affymetrix(于2016年被賽默飛收購)、安捷倫等。

    微流控芯片

    微流控芯片( microfluidic chip) 由微米級流體的管道、反應器等元件構成,與宏觀(guān)尺寸的分析裝置相比,其結構極大地增加了流體環(huán)境的面積/體積比,以最大限度利用液體與物體表面有關(guān)的包括層流效應、毛細效應、快速熱傳導和擴散效應在內的特殊性能,從而在一張芯片上完成樣品進(jìn)樣、預處理、分子生物學(xué)反應、檢測等系列實(shí)驗過(guò)程。目前使用微流控芯片進(jìn)行指導用藥的多基因位點(diǎn)平行檢測是主要臨床應用領(lǐng)域。

    分子診斷的高速發(fā)展離不開(kāi)分子生物學(xué)技術(shù)日新月異的進(jìn)步。

    在過(guò)去的50 年中分子診斷技術(shù)取得了三大轉化與3項提升:報告信號檢測從放射核素標記向熒光標記轉化、操作方法由手工操作向全自動(dòng)化轉化、檢測分析通量從單一標志物向高通量多組學(xué)聯(lián)合判斷轉化。

    不僅如此,儀器檢測靈敏度、精密度、特異性的也有快速提升。隨著(zhù)分子診斷技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展,分子診斷將會(huì )出現理念的革命性進(jìn)步,高通量技術(shù)將更多的進(jìn)入臨床的實(shí)際應用中。具體如何發(fā)展,我們拭目以待。

    分子診斷技術(shù)是指以DNA和RNA為診斷材料,用分子生物學(xué)技術(shù)通過(guò)檢測基因的存在、缺陷或表達異常,從而對人體狀態(tài)和疾病作出診斷的技術(shù)。其基本原理是檢測DNA或RNA的結構是否變化、量的多少及表達功能是否異常,以確定受檢者有無(wú)基因水平的異常變化,對疾病的預防、預測、診斷、治療和預后具有重要意義。

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